Выделенный нами из гепатопанкреаса дальневосточного краба комплексный протеолитический препарат морикраза обладает высокой фибринолитической, АПАП (активность, подобная активатору плазмочена) активаторной и коллагенолитической активностями. Исходный препарат и его фракции были использованы для растворения рубцовой ткани в условиях in vitro. Показано, что максимальная используемая нами концентрация морикразы растворяла 10 мг рубца за 14-16 часов при температуре 37°С. Наиболее активной оказалась 3-я фракция, состоящая из коллагенолитической протеиназы РС и трипсина. 
Минимальную активность в отношении лизиса ткани проявила 5 фракция, состоящая преимущественно из трипсина. 
Полученные результаты дают основание для дальнейшего изучения морикразы и ее компонентов в условиях in vivo и in vitro с целью возможного практического применения. 
Ключевые слова: протеазы, фибринолитическая активность, рубец, коллагенолитическая активность 

ВВЕДЕНИЕ. Препарат морикраза, разработанный НПО "Тринита" совместно с химическим факультетом МГУ им. М.В. Ломоносова, получен из гепатопанкреаса дальневосточного краба Paralithodes camtshatic (PС) по оригинальной методике [1]. Он представляет собой комплекс эндопротеиназ и экзопептидаз [1-5]. Наряду с общей протеолитической активностью, он обладает высокой фибринолитической [4, 6] и плазминоподобной активностями и способен активировать плазминоген [6]. При исследовании в условиях in vitro он способен растворять стабилизированный фибрин, активировать плазминоген, отщепляя от него пептид и превращая неактивный профермент в активный - плазмин, а также растворять образованные в пробирке сгустки человеческой и крысиной крови. Интересно, что скорость лизиса им сгустков человеческой крови значительно выше, чем растворение сгустков из крови крыс. Это связано, возможно, с разным уровнем ингибиторной активности в плазме человека и крысы. Введенный внутривенно белым крысам, препарат значительно повышал фибринолитический потенциал крови, не вызывая побочных эффектов и летальных исходов. Нанесенный на поверхность инфицированной раны, образовавшейся в следствие травмы на шее крысы, препарат способствовал быстрому ее заживлению. На модели венозного тромбоза в эксперименте in vivo, морикраза вызывала лизис тромбов у 90% крыс в течении 3-4 часов [6]. 
Кроме этих свойств морикраза обладает и высокой коллагенолитической активностью, выявленной методом вискозометрии, в 2-3 раза превышающей аналогичную активность известных отечественных коллагенолитических препаратов, например дигестазы, из гепатопанкреаса камчатского краба, полученного другим способом. 
Целью настоящего исследования было изучение возможности растворения рубца, состоящего, в основном, из коллагена, в условиях in vitro комплексным препаратом морикразы и ее фракциями. 
МЕТОДИКА. Субстратом для морикразы и ее фракций служили образцы тканей, взятые во время операции по иссечению рубцов лица, шеи и ушной раковины в НИИ Стоматологии. Сразу после взятия образцы помещали в ледяную баню, затем замораживали при t - 40°С и при этой температуре хранили до начала исследования. Перед началом эксперимента рубцы размораживали, брали навески по 10 мг и помещали в пробирки, содержащие разные концентрации (2 мг/мл, 1 мг/мл и 0,5 мг/мл) морикразы или равные объемы ее фракций. Затем пробирки помещали в суховоздушный термостат при 37°С и отмечали время растворения рубцовой ткани. 
Препарат морикразы получали описанным ранее методом [1]. Фракционирование суммарного препарата проводили с помощью анионообменной хроматографии на аминосилохроме. Из морикразы (фракция 1) были получены фракция 2 (смесь протеиназ) и фракция 3 (коллагенолитическая протеиназа РС и трипсин РС). Фракцию 2 рехроматографировали на колонке с ДЭАЭ - сефадексом. Получили фракцию 4 (эластаза РС и карбоксипептидаза РС) и фракцию 5 (преимущественно трипсин РС). 
Все фракции исследовали на способность фермента превращать плазминоген в плазмин, (АПАП), плазминоподобную и фибринолитическую активности. Результаты оценивали по времени лизиса сгустка эуглобулиновой фракции плазмы и зонам лизиса на фибриновых прогретых и непрогретых пластинах после нанесения на них раствора эуглобулинов [7]. 
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Используемая максимальная концентрация морикразы соответствовала 700 мм2 фибринолитической, 500 мм2 АПАП и 90 мм2 плазминоподобной активностям. При разведении в 2 и 4 раза снижение фибринолитической активности происходило, в основном, за счет АПАП (рис. 1). Навеска рубца, помещенная в раствор с максимальной концентрацией морикразы, растворилась за 14-16 часов, с минимальной - через 3 суток. В качестве контроля, вместо морикразы был использован физиологический раствор. 
 
Рисунок 1. 
Изменение общей фибринолитической, АПАП и плазминоподобной активностей препарата морикразы в зависимости от его концентрации. 
Во всех полученных фракциях морикразы были определены концентрации белка (табл.), фибринолитическая, АПАП и плазминоподобная активности (табл., рис. 2). Наибольшей удельной активностью обладали фракции 4 и 5 (табл.). Изучение в динамике изменения веса образца рубца под действием каждой из фракций выявило, что наиболее активна - 3 фракция, а практически неактивна в отношении лизиса рубцовой ткани - пятая. Результаты показали, что фракция 3, обладающая удельной фибринолитической активностью 444,5 условн.ед./мг белка (содержание белка 1,5 мг/мл) оказалась более активной в отношении коллагенолиза, а 5 фракция с высокой удельной фибринолитической активностью 3266,6 и содержанием белка 0,2 мг/мл, практически не лизировала рубец (рис. 3). 
Таблица 1. Содержание белка и фибринолитическая активность фракции РС. 
№ фракции  содержаниебелка (мг/мл)  фибринолитическаяактивность (мм2)  удельная фибринолитическаяактивность (условн.ед./мг белка) 
1  1,1  840  254,5 
2  1,05  1400  444,4 
3  1,5  2060  457,7 
4  0,6  1380  766,6 
5  0,2  1960  3266,6
 
Рисунок 2. 
Фибринолитическая, плазминоподобная и активаторная активности в 1-5 фракциях морикразы. 
 
Рисунок 3. 
Время растворения рубцовой ткани в растворах 1, 2, 3 и 5 фракциях морикразы. 
Проведенное исследование отдельных фракций показало, что только 3 фракция содержит коллагенолитическую сериновую протеиназу РС (5), что по-видимому и обеспечивает лизис рубца, содержащего плотную фиброзную соединительную ткань с коллагеновыми волокнами различной зрелости. 
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования отдельных фракций комплексного препарата морикразы в зависимости от целей его применения и дают основание для дальнейшего изучения морикразы и ее фракций в условиях как in vitro, так и in vivo. 
ЛИТЕРАТУРА 
1. Исаев В.А., Руденская Г.Н., Купенко О.Г., Степанов В.М., Попова И.М., Диденко Ю.Г. (1991) Способ получения препарата коллагеназы патент 2008353 от 5 августа Бюлл.изобр.№4, 1994 г. 
2. Климова О.А., Ведищева Ю.В., Стронгин А.Я. (1991) Докл.Акад.Наук СССР, 317 (2), 482-484. 
3. Руденская Г.Н., Исаев В.А., Степанов В.М., Дунаевский Я.Е., Баратова Л.А., Калебина Т.С., Нурминская М.В. (1996), Биохимия, 61, 1119-1132. 
4. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е., Митькевич О.З. (1994) Биорг.химия, 20, (2), 190-195. 
5. Sacharov I.Yu., Litvin F.E. (1990), Comp. Biochem. Physiol., V.B, 407-410. 
6. Исаев В.А, Лютова Л.В., Карабасова М.А., Руденская Г.Н., Купенко О.Г., Андреенко Г.В. (1993) Тезисы докладов и сообщений III Симпозиума Химия протеолитических ферментов, Москва, 111. 
7. Методы исследования фибринолитической системы крови, (ред. Г.В.Андреенко) (1981), из-во МГУ, Москва 
THE EFFECT OF PROTEOLYTIC PREPARATION MORICRASA ON CICATRICIAL TISSUE IN VITRO 
L.V. LYUTOVA, M.A. KARABASOVA, G.V. ANDREENKO, G.N. RUDENSKAYA, V.A. ISAEV, A.B. BRUSOV 
School of Biology, M.V.Lomonosov Moscow State University, Vorobjovi Gori, Moscow, 117234 
Proteolytical preparation moricrasa was isolated from hepatopancreas of Paralithodes camtshatic. Moricrasa and its fractions were used for lysis of cicatricial tissue under in vitro conditions. It was found that moricrasa in concentrations 0,5 mg/ml and 2 mg/ml lysed the cicatrix during 72 and 14-16 hours, respectively. 
The fraction consisted of collagenolytic proteinase PC and trypsin relealed maximal activity of fraction of moricrasa was absent. 
Key words: proteases, fibrinolysis, cicatrix, colagenolytic activity. 
 
август 2000